5. Diferenciação experimental entre enantiómeros

5.1. Actividade óptica

A similaridade estrutural entre pares de enantiómeros reflecte-se igualmente nas suas propriedades físicas e químicas. De um modo geral, estas propriedades são idênticas em meios isotrópicos o que torna difícil a distinção entre eles, bem como o seu isolamento e separação. Até recentemente, resolver uma mistura racémica, isto é, separar individualmente cada um dos constituintes de um par de enantiómeros, era uma tarefa laboriosa, envolvendo recristalizações fraccionadas ou conversão do par de enantiómeros em diasterómeros (isómeros configuracionais que não são a imagem do espelho um do outro). Bem mais difícil ainda era reconhecer a presença de pares de enantiómeros em matrizes de origem biológica.
Em meios anisotrópicos, contudo, cada um dos enantiómeros de um par comporta-se de modo diferente e distinguível. A sua capacidade de interacção com a luz polarizada, promovendo a rotação do plano de vibração em sentidos opostos (actividade óptica), introduziu na gíria, como sinónimo de compostos quirais, a expressão de compostos opticamente activosou isómeros ópticos.
 A luz é o resultado do movimento ondulatório de um campo magnético e de um campo eléctrico oscilatórios perpendiculares entre si. As ondas luminosas são compostas por dois tipos de luz circularmente polarizada movendo-se em torno do eixo de propagação num movimento helicoidal, para a direita e para a esquerda, numa relação especular. Na luz normal, os vectores eléctricos encontram-se orientados em todas as direcções. Na luz polarizada, os vectoreseléctricos encontram-se todos no mesmo plano.O fenómeno da actividade óptica é determinado pelos índices de refracção para cada um dos tipos de luz, direita e esquerda, num dado meio. Se o meio é aquiral os índices de refracção são iguais para ambos e o vector resultante emerge do meio sem alteração. Num meio quiral, os índices de refracção já não são iguais e o vector resultante aparece com o plano de polarização rodado numa dada direcção segundo umângulo alfa :

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Figura 3. Esquema de um instrumento- o polarímetro- para medir arotação do plano da luz polarizada provocada por uma substância opticamente activa (rotação óptica).

O ângulo alfa representa o desvioóptico e é, para uma dada substância, a uma dada temperatura t e para um dado comprimento de onda l, proporcional ao percurso atravessado pelo feixe no meio quiral (comprimento da célula em dm) e à concentração da solução atravessada pelo feixe (em g/ml). A correlação de todas estas variáveis é uma grandeza característica de cada composto opticamente activo e denomina-sepoder rotatório específico.

Sendo os enantiómeros imagens especulares um do outro, o desvio do plano da luz polarizada a é igual para ambos mas de sinal contrário. O responsável por uma rotação do plano da luz polarizada para a direita (+) é denominado dextrogiro ou dextro-rotatório e o seu antípoda (-) é denominado levogiro ou levo-rotatório.

5.2. Estereo-selectividade enzimática

O primeiro sistema para a diferenciação de enantiómeros foi, afinal, logo descrito por Pasteur quando mostrou que as levedura e o bolores eram capazes de consumir preferencialmente um dos enantiómeros do tartarato de amónio racémico. De facto, a actividade enzimática possui uma estereo-selectividade intrínseca geral. Por exemplo, com excepção de alguns casos em micro-organismos, apenas os aminoácidos L são bioquímicamente utilizáveis. O mesmo se verifican o campo da farmacologia, dos aromas, dos sabores, etc., onde apenas um enantiómero possui efectiva acção terapêutica, ou possui odor ou gosto diferentes do seu antípoda (relação eudísmica). A actividade biológica de compostos opticamente activos não é idêntica para ambos os enantiómeros. Uma explicação simplista para este fenómeno, mas ilustrativamente esclarecedora, é a chamada teoria dos três pontos. A formação do complexo enzima-substracto só é possível para um dos enantiómeros com a configuração correcta definida no local activo da enzima por três pontos de interacção:
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Figura 4. A orientação dos pontos de interacção no local activo da enzima define a configuração correcta do substracto.

A investigação e os progressos de conhecimento e compreensão das relações entre quiralidade e actividade biológica podem considerar-se ainda nos seus primeiros passos e apenas são possíveis pelo desenvolvimento de técnicas analíticas adequadas, nomeadamente técnicas cromatográficas.

5.3 Cromatografia quiral

A similaridade de propriedades físicas e químicas entre pares de enantiómeros em meios aquirais torna a sua diferenciação e separação muito laboriosas. Dada a sua alta eficiência, os processos cromatográficos de alta resolução são o método de escolha. O processo mais simples e mais antigo para levar a cabo a separação de dois enantiómeros consiste em transformá-los em diasterómeros, ou seja, isómeros configuracionais que não são a imagem especular um do outro:

Uma vez que diasterómeros possuem propriedades físicas e químicas diferentes,a sua separação pode ser conseguida pelos métodos clássicos de separação, incluindo cromatografia. No entanto, sob o ponto de vista cromatográfico, este processo possui inconvenientes de alguma importância:

1- Requer transformação de um composto em outro (derivatização). A reacção para ambos os enantiómeros tem de ser completa.

2- É praticamente impossível obter um reagente enantiomericamente puro. A presença de contaminação por um dos enantiómeros do reagente quiral conduz a uma concentração relativa de derivados distereoméricos diferente das proporções reais dos dois enantiómeros originais.

3- As estruturas quirais susceptíveis de derivatização adequada são limitadas, isto é, o processo não é geral.

Todas estas limitações retardaram enormemente o desenvolvimento da compreensão das relações entre quiralidade e actividade biológica. A introdução e desenvolvimento explosivo de fases estacionárias quirais para cromatografia modificou drasticamente esta situação, fornecendo aos investigadores um poderosíssimo instrumento analítico para detecção, separação e quantificação de estereoisómeros ópticos. Os avanços nesta área são de transcendental importância em biologia e bioquímica, nutrição, investigação criminal e farmacologia.

A separação cromatográfica quiral baseia-se em levar os componentes de uma mistura a percorrer um meio adequado com o qual interactuam fisicamente(fase estacionária) arrastados por um fluido líquido (cromatografia líquida) ou gasoso (cromatografia gasosa) adequado (fasemóvel). Dos diferentes equilíbrios dinâmicos estabelecidos entre cada um dos componentes com ambas as fases móvel e estacionária resultam diferentes velocidades de percurso (tempo de retenção) para cada um que, deste modo, emergem do meio a tempos diferentes. A separação cromatográfica de isómeros ópticos em fases estacionárias quirais, resulta da formação reversível de complexos diastereoméricos de diferente estabilidade entre cada um dos enantiómeros constituintes de um par e a fase estacionária quiral (mais raramente a fase móvel). Tal resulta numa diferença de tempos de retenção e consequente separação. A Figura 5 ilustra a aplicação do método a algunsexemplos de relevância medicamentosa e nutricional:

HexabarbitalDiltiazemOxazepam
Figura 5. Exemplos de separações enantioméricas por cromatografia líquida quiral

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